恶性血液肿瘤主要包括白血病，骨髓病和淋巴病，是威胁全世界人类健康的主要恶性肿瘤之一，尽管新的研究技术和手段为血液肿瘤的治疗带来了希望，但是其发病率和死亡率仍然很高，尤其是白血病和MM。OVV治疗目前成为新型的抗肿瘤治疗之一，其不仅能凭其溶瘤效应激发体内的免疫应答，还能作为基因治疗工具介导外源治疗性基因的表达并发挥抗肿瘤效果。本课题分为两部分，第一部分是携带miR-34a和携带Smac的溶瘤痘苗病毒联合治疗多发性骨髓病的研究。第二部分是溶瘤痘苗病毒介导的Beclin-1基因过表达诱导的自噬对血液肿瘤的增殖抑制作用的研究。

　　第一部分、携带miR-34a和携带Smac的溶瘤痘苗病毒联合治疗多发性骨髓病的研究

　　目的:构建携带miR-34a基因的溶瘤痘苗病毒OVV-miR-34a并研究它与OVV-Smac联合抑制MM细胞的增殖作用及其相关机制。

　　方法:采用基因工程技术构建OVV-miR-34a;通过荧光显微镜和FACS技术检测OVVs对MM细胞的感染效率;利用MTT法检测对照病毒OVV，OVV-miR-34a，OVV-Smac及双病毒联合对MM细胞株的体外生长抑制作用，同时感染正常细胞株和人正常原代细胞株检测OVVs的安全性;采用Real-time PCR和Western blot技术检测OVVs体外表达miR-34a和Smac的能力，以及对miR-34a的靶基因和Smac下游蛋白的调控;通过Werstern blot和AnnexinⅤ/PI双染检测OVVs感染MM细胞后，是否有细胞凋亡的诱导和capase信号通路激活;采用激光共聚焦显微镜观察Cytochrome c从线粒体内膜释放到胞浆的过程;构建RPMI-8226荷瘤裸鼠模型并瘤内注射OVVs，检测不同OVVs在体内抗肿瘤效果;组织病理学检测OVV-miR-34a与OVV-Smac体内抗肿瘤机制。

　　第二部分、溶瘤痘苗病毒介导的Beclin-1基因过表达诱导的自噬对白血病和骨髓病细胞增殖的抑制作用的研究

　　目的:构建新型的溶瘤痘苗病毒OVV-Beclin1，并研究其诱导血液肿瘤细胞发生自噬性死亡途径及抑制血液肿瘤细胞增殖的效应。

　　方法:采用基因工程技术构建携带自噬诱导基因Beclin1的新型溶瘤痘苗病毒OVV-Beclin1。利用OVV-GFP感染白血病细胞株HL-60和K562检测OVVs对白血病细胞的感染效率。采用免疫荧光染色技术(IP)以内质网标记蛋白Calreticulin作为内参，运用激光共聚焦显微镜观察经OVV增强表达的Beclin1在细胞质内的亚定位。通过Real-time PCR和Western blot技术检测目的基因Beclin1在mRNA和蛋白水平上的增强表达。利用MTT法检测OVV和OVV-Beclin1对白血病和MM细胞株体外生长抑制作用，同时感染正常细胞株和人正常原代细胞检测OVVs的安全性。

　　　结论:本课题成功构建了新型的溶瘤痘苗病毒OVV-Beclin1。体外、体内实验结果证明OVV-Beclin1能有效地诱导自噬性细胞死亡途径，并抑制血液肿瘤细胞，包括白血病和MM的增殖。本课题首次将OVV治疗策略与自噬性细胞死亡相结合治疗血液肿瘤，为溶瘤病毒治疗恶性血液肿瘤的临床研究提供理论基础。